博溪生物副总经理李潇，在由荣格主办的口腔护理产品创新论坛上分享了《口腔护理产品体外功效评价策略》。
报告内容分为两个部分，在《口腔护理报告（上）——口腔结构及常见口腔问题》中，对口腔结构及主要构成单元、常见口腔护理问题以及口腔护理产品市场及法规要求等三个部分进行了分享。
本篇的主要内容为口腔护理产品体外功效评价策略。
Four
口腔护理产品体外功效评价策略与应用
在了解了口腔护理产品市场现状以及法规要求之后，接下来将重点介绍口腔护理产品的体外功效评价策略和应用。
01
抗龋齿
龋病不是一个单向的脱矿过程，它是无数次脱矿和再矿化积累的结果。
从龋齿的发病机制出发，抗龋齿的产品开发主要针对两个方面，拮抗致病菌生长和诱导再矿化过程。那么对于抗龋齿的功效评价，就从抑菌和牙齿脱矿与再矿化两个角度进行。
抗龋齿的抑菌实验中，我们采用变形链球菌和发酵乳杆菌作为主要的致病菌，检测产品或配方，对两种模式微生物是否具有抑菌功效，可以通过菌落计数法和抑菌环法来进行检测。
图1抑菌检测结果
牙齿脱矿与再矿化实验也同样可以评估牙膏是否具有抗龋齿功效。离体牛牙经过酸化后发生脱矿，再使用待检测产品，利用扫描电镜观察牛牙牙釉质表面形态变化、钙磷质量比值（Ca/P），以及检测表面硬度情况来综合评估产品是否促进牙齿脱矿后再矿化的功效。
从下图中可以看出，在对离体牛牙进行脱矿处理前，牛牙表面的牙釉质微粒排列整齐、致密，且并没有出现微孔或凹凸不平的蜂窝状结构，而经过酸化处理后，牛牙发生脱矿，牙釉质表面出现大量微孔及蜂窝状结构。
图2离体牛牙脱矿前后、再矿化SEM图
样品是否具有防龋效果，则可以通过检测其是否使脱矿牛牙发生再矿化进行评价。样品可以使牙釉质表面微粒重新排列整齐，蜂窝状结构减少，即样品具有防龋功效。
02
牙齿美白
引起牙齿变色的原因包括内因和外因，牙齿美白功效评价则主要针对能够去除牙齿外源性色斑的原料、配方或产品。
体外的牙齿美白功效评价测试主要基于离体牛牙来进行——首先我们会用茶渍对离体牛牙进行体外染色，牛牙着色后，我们会通过对比产品使用前后，牛牙外观颜色的改变以及色度仪检测的色差值，来综合评估产品是否具有美白效果。
下图为一款牙膏美白效果测试的案例，从图中可以看出，样品可以有效去除牙齿外源性色斑，达到良好的牙齿美白功效。
图3基于离体牛牙的牙膏美白功效检测结果
左边1-9号牛牙即是统一染色后的状态，在经过牙膏一段时间使用后，牛牙的颜色改变显著。除了可以直观地观察到牛牙表观颜色的变化之外，还可以通过色度仪的量化结果来进行检测。
03
抗牙本质敏感
在抗牙本质敏感的功效评价中，可以采用牙小管封闭实验来进行：
通过酸蚀离体牛牙的牙本质切片，使牙小管暴露，从而模拟人体因牙小管暴露造成的牙齿敏感现象，检测空白组和不同时间点的样品组中，牙小管的封堵情况，来评价样品是否具有抗牙本质敏感功效。
图4牙本质切片酸蚀后牙小管暴露
引起牙本质敏感最根本的原因是，刺激通过暴露的牙本质小管传递至神经，进而引起一系列不适的主观感受，因此通过神经兴奋的阻断，也能够很好地达到抗牙本质敏感功效。
体外的检测主要是对神经元细胞电刺激后，通过膜片钳技术来评估待测样品是否能够对神经元细胞的动作电位或神经兴奋产生抑制作用。
如图，正常情况下，神经元细胞受到刺激后，有一定频次的电位变化，即产生神经兴奋，而样品作用后，动作电位得到了显著的抑制，因此可以说明样品具有神经镇静舒缓作用。
图5基于神经元细胞的样品神经镇静舒缓作用检测结果
04
减轻牙龈问题
牙龈炎症的发生也与口腔中的微生物密切相关，牙龈炎发生的早期，由链球菌和革兰氏阳性杆状菌等初始定植者主导，随着生物膜逐步成熟，允许更多微生物定植则会引发牙龈炎，持续的演替后，形成牙周炎。
部分口腔护理用品可以减少炎症因子及炎症介质的表达，这在功效评价中则被归为减轻牙龈问题。在体外的话，我们主要基于口腔来源的细胞，通过刺激物或压力等诱导，建立炎症模型，然后通过检测样品对炎症因子和炎症介质表达的作用来进行评价。
图6样品降低炎症因子、炎症介质表达
除此之外，对口腔黏膜的保护作用也可以归于减轻牙龈问题中。与口腔黏膜保护作用对应的口腔问题就是黏膜损伤，比如口腔溃疡就是黏膜组织受到炎症损伤后的一种典型症状。
在机体自身对口腔黏膜的修复中，涉及到的主要是口腔黏膜上皮细胞的爬行、迁移，以及纵向细胞填补损伤区域等过程。
在体外细胞水平对原料或漱口水等产品进行口腔黏膜保护作用的功效检测时，主要是通过开展划痕实验，检测样品能否促进细胞迁移，从而评价样品功效。
图7细胞相对迁移率检测结果
而检测牙膏等表活成分比例较高的产品时，细胞可能会不耐受，因此要基于组织层面进行检测，如利用博溪生物自主开发的3D口腔黏膜上皮模型（EpiOriis），模型与人体口腔黏膜高度一致，尤其是黏膜特征性表达的角蛋白，无论是表达部位还是表达量都比较接近。
那么基于3D口腔黏膜上皮模型，我们可以通过LPS刺激，建立黏膜损伤模型，而后检测使用样品后的组织活力和屏障指数，来综合评价产品的功效。
总结一下，体外对口腔护理产品的功效评价主要是基于离体牛牙、3D口腔黏膜上皮模型以及体外培养的口腔细胞，如口腔黏膜上皮细胞、牙龈成纤维细胞、神经元细胞等来进行评价，而多种模型、多维度的体外检测已经能够覆盖到法规规定的美白、防龋、抑制牙菌斑、减轻牙龈问题等等。
随着口腔产品市场规模进一步扩大，口腔护理产品的法规和相关标准也会逐步细化，博溪也将持续探索，为口腔护理产品的功效评价贡献更多力量~